05 octubre 2006

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS

Una lectora del blog me plantea la siguiente pregunta que creo que puede ser interesante para todos por eso la contesto aquí en un post.

necesito conocer la tecnica de realizacion de electroforesis de hemoglobinas para poder realizarla a modo de docencia en el Hospital San Bernardo de la Provincia de Salta, gracias

1)PREPARACION DEL HEMOLIZADO


La sangre se extrae sobre EDTA, heparina u oxalato. 2 mL de sangre se centrifugan en un tubo de 10 mL. Se elima el plasma sobrenadante con una pipeta Pasteur. Se lava el deposito de hematíes con solución salina llenando todo el tubo 3 veces ( es decir lavar ,agitar, eliminar sobrenadante y volver a centrifugar cada vez). Incorporar 2 volumenes de agua destilada al deposito de hematíes lavados y agitar. Transferir el hemolizado a un tubo de vidrio y añadir medio volumen de tolueno, con arreglo al deposito. Tapar y agitar fuertemente. Dejar a 4ºC hasta el día siguiente.
Centrifugar. La mezcla se separa en 3 capas de arriba a abajo: el tolueno, una pasta sólida conteniendo los estromas y una solución de hemoglobina. La solución de hemoglobina se toma con una pipeta Pasteur introduciendola al fondo del tubo. Esta solución se centrifuga de nuevo.
El hemolizado viene a contener unos 10 g/dL de he
moglobina. Se puede conservar a 4ºC.
Los hemolizados hay que rebajarlos hasta unos 3 g/dL, diluyendolos .

2) ELECTROFORESIS

Recomiendo la tecnica sobre Cellogel RS que asegura separaciones muy finas ya que permite la dosificación de HbA2 y la detección de HbF a concentraciones del 1%. Se practica una electroforesis normal pero con un tampón de TRIS-Glicocola de pH 9,2. La aplicación se puede hacer doble sobre el mismo punto. Migración de 300 v durante 90 minutos.
Se recomienda teñir sobre Negro de amido, aunque se puede usar Rojo Ponceau, decolorar como de costumbre y transparentar.

3) RESULTADOS

Las hemoglobinas migran del cátodo al ánodo. La hemoglobina F migra un poco menos que la hemoglobina A. La HbS, HbC, y HbE se separan bien de la HbA.La HbS migra entre la A y la A2.La HbC y la HbE migran al nivel de la HbA2 que ellas enmascaran. Es muy conveniente hacer a la vez un testigo con una sangre normal para comparar. Como se observa en el dibujo tambien aparecen 2 bandas correspondientes a las anhidrasas carbónicas b y c de los hematíes.

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